歡迎來北京茄子视频官网下载科技有限公司!茄子视频官网wwwqz8app在线將為您提供周到的服務!
產品分類Product categories
首頁 > 技術文章 > 教你成為平淡無奇的WB實驗小能手—樣本製備篇(續)
教你成為平淡無奇的WB實驗小能手—樣本製備篇(續)

 WB實驗流程

 

 

 

樣本製備的步驟

 

 

關於樣本采集和保存,蛋白提取的相關

知識和技巧請查看:

 

接下來,讓小編帶您總結關於蛋白定量和蛋白變性相關的知識點:

 

蛋白定量

測定蛋白常用的方法有Bicinchoninic acid (BCA)法Lowry法Bradford法(考染法)

 
 

1. BCA法的測定原理是蛋白質將銅離子還原成亞銅離子,後者在堿性溶液中與BCA結合生成紫紅色結合物,該複合物在562nm處有吸光值且與蛋白質濃度成正相關性,據此可測定蛋白質濃度。考馬斯亮藍在遊離狀態下呈紅色,最大光吸收在488nm;當它與蛋白質結合後變為青色,蛋白質—色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比,因此可用於蛋白質的定量測定。

 
 

 

 
 

2. Lowry法又稱為Folin-酚試劑法,首先在堿性溶液中形成銅-蛋白複合物,然後這一複合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚上級),產生鉬藍和鎢藍複合物的深藍色,這種深藍色的複合物在745~750nm處有最大的吸收峰,顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比,可根據750nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量。

 
 

 

 
 

3. Bradford法又稱為考染法。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高,可檢測到微量蛋白,操作簡便,試劑配製極簡單,重複性好,但幹擾因素多。考馬氏亮藍G-250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中遊離狀度下為棕紅色,當它通過疏水作用與蛋白質結合後,變成藍色,最大吸收波長從465nm轉移到595nm處,在一定的範圍內,蛋白質含量與595nm的吸光度成正比,測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。

 
 

 

三者之中,Lowry法與BCA同屬化學法,Lowry法是藥典中使用的蛋白濃度測定方法,但是操作繁瑣,實驗時間長。BCA法操作簡單,時間短,形成的顏色複合物穩定性強,但可能受一些雜質影響。Bradford屬於染料結合法,也易受到去垢劑影響。

 

蛋白變性

蛋白變性常用方式是高溫煮樣,煮樣條件設置為100℃,根據樣品量的多少,設置時間5~15min,煮樣時間過長,一些蛋白可能會產生聚集性沉澱。疏水性極強的蛋白質,如含有多個跨膜結構域的蛋白質,在煮沸時可能會發生聚集或寡聚化,因此,其煮樣條件為40℃~55℃條件下,溫浴10~60min變性。煮樣後的樣本於-20℃或-80℃保存。

提取並定量後,並未加Loading Buffer煮樣的蛋白樣品,保存於-80℃時,防止反複凍融,並盡量於1周內加Loading Buffer煮樣處理,不要超過2周。

 

在此,為了幫您更好地完成實驗,茄子视频官网下载推薦茄子视频官网wwwqz8app在线蛋白定量和蛋白變性相關的配套產品。

產品名稱

產品貨號

Bradford法蛋白濃度測定試劑盒

PC0010

BCA蛋白濃度測定試劑盒

PC0020

Lowry法蛋白濃度測定試劑盒

PC0030

4×蛋白上樣緩衝液

(含DTT)

P1015

4×蛋白上樣緩衝液

(含巰基還原劑)

P1016

4×非變性蛋白上樣緩衝液

P1017

 

版權所有  ICP備案號:京ICP備12051307號-5 管理登陸 技術支持:化工儀器網   總流量:252632  網站地圖

在線客服
在線客服
用心服務 成就你我